由于人口老龄化及心血管病危险因素的日益流行，我国冠状动脉粥样硬化性心脏病的患病率及死亡率整体呈现逐年上升的趋势[1]。对于合并多支冠状动脉病变的患者，冠状动脉旁路移植术是其首选治疗方法[2]。但约有 30%～40% 的静脉桥会在术后 1 年内失效，高达 70% 的静脉桥在 10 年后将完全闭塞，严重影响患者的生活质量和远期生存[2]。
新生内膜增生（neointimal hyperplasia，NIH）及进行性粥样硬化是冠状动脉旁路移植术后静脉桥中远期失效的中心环节[3-8]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和内向性迁移是 NIH 的关键因素[3-8]。因此，负向调控 VSMCs 的增殖迁移，可有效抑制 NIH 及静脉桥增殖性重构[8-10]。
血管损伤及血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等生长因子和细胞因子的刺激，可促使 VSMCs 发生表型转换及增殖迁移[3-4, 11-13]。研究[12-14]发现，神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表达上调与 PDGF 诱导的人和大鼠的 VSMCs 增殖迁移密切相关。但是，NRP1 在 VSMCs 生物学功能中的作用及相关调控机制尚未阐述清楚。本研究将通过 NRP1 基因干扰腺病毒靶向抑制 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表达，探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 增殖、凋亡和迁移中的功能作用以及其可能介导的相关下游信号传导通路，初步探讨 NRP1 在静脉桥增殖重构进程中的潜在作用。
1 材料与方法
1.1 细胞来源
本实验所用大鼠 VSMCs：型号 A7r5，购置于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（来源于美国 ATCC 公司，保持了原有细胞的基本生物学特性）。
1.2 主要实验试剂
主要实验试剂包括：NRP1 兔来源单克隆抗体（Abcam，英国）、胎牛血清（BioInd，以色列）、DMEM 培养基（Thermo Fisher，美国）、DMSO（Sigma，美国）、CCK-8 试剂盒（MCE，美国）、PBS（北京索莱宝）、PDGF-BB（Peprotech，#100-14B，美国）、蛋白上样指示剂（BIO-RAD，美国）、PVDF 膜（Millipore，美国）、RIPA 细胞/组织高效裂解液（北京索莱宝）及 Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒（北京四正柏）。
1.3 主要实验器材
细胞培养箱（BINDER，美国）、脱色摇床（OHAUS，美国）、酶标仪（Bio TEX，美国）、电泳仪（BIO-RAD，美国）、化学成像系统（BIO-RAD，美国）、荧光定量 PCR 仪（BIO-RAD，美国）、流式分析仪（Beckman Coulter，Navios，美国）、倒置荧光显微镜（ZEISSm，OBSERVER D1，德国）、图像采集系统（ZEISS，AX10 cam HRC，德国）。
1.4 研究方法
1.4.1 NRP1 基因靶向干扰腺病毒的构建
委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成。登录美国 Gene Bank 数据库（网址
1.4.2 大鼠 VSMCs 鉴定
采用 STR 多重荧光试剂盒对样品 DNA 进行扩增，然后使用 DNA 分析仪（Applied Biosystems）对 PCR 产物进行分析比对以排除大鼠 VSMCs 细胞被人源细胞交叉污染；通过对样品的 COX-1 基因进行扩增与电泳测试，获取基因条带，根据 COX-1 条带大小判断物种来源；制作大鼠 VSMCs 细胞爬片，通过免疫组化检测平滑肌细胞标志物 α-SMA 来确证该细胞系是否是平滑肌细胞。
1.4.3 检测大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达情况
1.4.3.1 实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）测定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达
细胞 RNA 采用 Magen 公司的 RaPure Total RNA Kit（单柱法）试剂盒进行提取。将提取到的总 RNA 逆转录合成 cDNA，逆转录体系中 RNA 的体积根据 RNA 浓度计算：需要的 RNA 质量/浓度，20 μL 逆转录体系中，SYBR Green qPCR 最多可使用 1 μg 总 RNA；在冰上配置去基因组 DNA 反应混合液；42 ℃ 反应 2 min，去除基因组 DNA；再在冰上配制逆转录反应混合液；瞬时离心，普通 PCR 仪进行逆转反应生成 cDNA（反应条件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s），所得 cDNA 于-20 ℃ 冰箱保存。使用 Primer Premier 6 软件设计 qPCR 引物序列，在 NCBI Primer-BLAST 中验证，使用 β-actin 作内参基因，配制 qPCR 反应混合物 10 μL，瞬时离心，荧光定量 PCR 仪上机检测，利用 Bio-Rad iQ 5 软件进行分析。确定 Ct 值，并计算 ΔCt 值（目标基因 Ct 值-内参 β-actin 的 Ct 值）。再计算 ΔΔCt（试验组 ΔCt-对照组 ΔCt），再以 2ΔΔCt 计算相对拷贝数。相同基因 ΔΔCt 越大，相对拷贝数就越低，基因表达量就越低。
1.4.3.2 WB 测定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达
将培养瓶或 6 孔板放在冰块上，用预冷 PBS 洗涤细胞 2～3 次，吸干 PBS 后，再加入预冷的 RIPA，使用细胞刮将贴壁的细胞从培养瓶壁刮下，然后将悬液转移至新预冷 EP 管，冰上放置 30 min，每 10 min 振荡一次，4 ℃ 预冷离心机中 13 000 rpm 离心 15～20 min，取出 EP 管置于冰上，吸出上清到预冷的新管中，弃去沉淀。将提取到的细胞蛋白按照碧云天 BCA 试剂盒说明进行蛋白浓度的测定，经过 SDS-PAGE 电泳和转模后进行抗体结合和检测。
1.4.4 实验分组
（1）阴性对照腺病毒（Ad.NC）组 在含 10%FBS 的 DMEM 培养的大鼠 VSMCs 中，转染不含基因序列的阴性对照腺病毒。
（2）NRP1 干扰腺病毒（Ad.shNRP1）组 在含 10%FBS 的 DMEM 培养的大鼠 VSMCs 中，转染负载 NRP1-shRNA 的腺病毒。
将长势良好的 VSMCs 接种到培养皿中，待细胞融合达到 50% 时给予最佳稀释度的腺病毒进行转染。培养皿置于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中孵育，病毒转染 48 h 后，细胞重新计数铺板，通过 qPCR 和 WB 检测 NRP1 表达情况，并分别进行细胞增殖活力、凋亡及迁移能力等检测。
1.4.5 CCK-8 检测细胞增殖活力
两组细胞的增殖活力采用 CCK-8（cell counting kit-8）试剂进行检测，其试剂中含有的 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，能被线粒体中的酶还原为高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye），而黄色甲瓒产物的量与活细胞数量成正相关。
1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡情况
取病毒转染后 48 h 的 VSMCs，细胞重悬计数后接种于 6 孔板，培养 48 h 后将 VSMCs 制成细胞悬液，充分混匀后 2 000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 100 μL Binding Buffer 重悬细胞，然后加入 2 μL Annexic V-APC 混匀，再加入 1 μL PI，轻轻混匀后避光室温孵育 15 min，再补加 200 μL Binding Buffer，40 μm 滤网过滤后，进行流式检测。
1.4.7 Transwell 检测细胞迁移能力
取病毒转染 48 h 后的细胞重悬，每个 Transwell 小室加入 5×104个细胞。上室为无血清 DMEM 培养基 200 μL，下室加入含 10% FBS 的完全 DMEM 培养基 600 μL，注意小室底部不可有气泡。继续培养 48 h 后取出细胞，取出小室后首先需擦除里面的细胞及液体，然后在下室中加入甲醇 600 μL 固定 30 min，风干，再用结晶紫染色液 600 μL 染色 20 min 后用 PBS 洗涤后晾干。显微镜下计数 3 个不同视野中穿过膜的细胞数，并计算平均值，若细胞数较少时可全部计数。
为了探索 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可能通过哪些信号通路发挥作用，我们挑选了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 这三条 VSMCs 增殖迁移过程中的经典信号通路进行研究。靶向干扰大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达后，分别检测其下游 Akt、ERK1/2 及 NF-κB 通路蛋白磷酸化和总表达水平的变化，推测 NRP1 在大鼠 VSMCs 中发挥作用可能介导的信号通路。
1.5 统计学分析
应用 SPSS 19.0 统计软件（SPSS Inc，Chicago，IL，美国）进行数据统计分析，GraphPad Prism 6 软件（GraphPad Inc，La Jolla，CA，美国）作图。数据以均数±标准差（
±s）表示，两组之间比较使用独立样本 t 检验，而多组之间比较则采用单因素方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠 VSMCs 鉴定结果
本研究中所使用的细胞在 STR 图谱中未检测到扩增峰，表明未受到人源细胞污染（图1a）。
图1
大鼠血管平滑肌细胞鉴定结果
a：STR 基因分型图谱；b：COX-1 基因电泳图谱（条带位于 196bp 处，常见物种 COX-1 基因大小：人类 391bp；恒河猴 287bp；长尾猴 222bp；牛 102bp；犬 172bp；大鼠 196bp；小鼠 150bp；仓鼠 315bp；昆虫 70bp）；c：免疫组化结果，红色为 α-SMA 蛋白，绿色为 DAPI 染色的细胞核（20×10 倍）
在 COX-1 基因电泳中，将仅有的位于 196bp 的条带与常见物种 COX-1 基因大小进行对比，提示本研究所使用的的细胞来源于大鼠并且不存在物种污染（图1b）。
细胞免疫组化结果显示 VSMCs 标志物 α-SMA 阳性表达，进一步证实本研究所使用的细胞为未受污染的大鼠 VSMCs（图1c）。
2.2 PDGF 及腺病毒的浓度选择
分别使用 0 ng/mL，15 ng/mL 和 30 ng/mL 的 PDGF-BB 诱导大鼠 VSMCs，通过 qPCR 和 WB 检测发现，在基因转录和翻译两种水平，NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表达均随着 PDGF 的诱导剂量逐渐增高，提示 PDGF 能够促进 NRP1 的表达（图2a）。因此，我们采用 30 ng/mL 的 PDGF-BB 进行后续研究。
图2
PDGF 及腺病毒的浓度选择
a：大鼠 VSMCs 中 NRP1 在不同浓度 PDGF 诱导下的表达情况（*：与 0 ng/mL 组比较，
使用构建的腺病毒感染大鼠 VSMCs，病毒转染后 48 h，采用流式细胞术检测 VSMCs 的存活率及荧光表达率。研究发现（图2b），在腺病毒 10–3稀释度下，VSMCs 的存活率为 85.4%，标记腺病毒的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达率为 93.4%；而在病毒 10-4稀释度下，VSMCs 存活率为 92.1%，GFP 表达率为 91.7%。综合评估得出腺病毒在 10-3稀释度下，对 VSMCs 可达到最佳的转染效果，遂以此稀释度下的病毒浓度进行后续实验。
2.3 腺病毒成功转染大鼠 VSMCs
荧光显微镜下可以看到 NRP1-shRNA 腺病毒和阴性对照腺病毒均成功转染 VSMCs（图3a）。通过流式细胞术检测观察到两组 GFP 表达率均达到 80%，病毒转染效率未见明显差别，满足细胞功能及机制研究的要求（图3b）。
图3
腺病毒成功转染大鼠血管平滑肌细胞
a：荧光显微镜下观察腺病毒在大鼠 VSMCs 中转染效率（20×10 倍）；b：流式细胞术检测腺病毒在大鼠 VSMCs 中转染效率
2.4 NRP1 基因靶向干扰腺病毒抑制大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达
通过 qPCR 及 WB 检测，NRP1 基因靶向干扰腺病毒转染大鼠 VSMCs 后，在基因及蛋白水平，NRP1 的表达均被显著抑制（图4）。
图4
靶向干扰腺病毒抑制 NRP1 在 VSMCs 中的表达
*：与 Ad.NC 组比较，
2.5 下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 增殖活力的影响
在探究 NRP1 对大鼠 VSMCs 具体生物学功能的影响时，首先采用 CCK-8 实验检测增殖活力的变化，结果显示在 24 h、48 h 和 72 h 时，Ad.NRP1 组细胞的增殖活力较 Ad.NC 组均有明显降低（图5），提示 NRP1 表达下调可以抑制大鼠 VSMCs 的增殖活力。
图5
CCK-8 检测 NRP1 表达下调对大鼠 VSMCs 增殖的影响
*：与 Ad.shNRP1 组比较，
2.6 下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 凋亡的影响
为了研究下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 凋亡的影响，我们采用了 Annexin V-APC/PI 双染法流式细胞术检测凋亡百分比，结果显示 Ad.NRP1 组细胞凋亡百分比显著高于 Ad.NC 组（图6），表明下调 NRP1 表达促进了大鼠 VSMCs 的凋亡。
图6
流式细胞术检测下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 凋亡的影响
*：与 Ad.NC 组比较，
2.7 下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 迁移能力的影响
在检测了抑制 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 增殖和凋亡的影响之后，进一步采用 Transwell 实验检测迁移能力的变化，结果显示 Ad.NRP1 组迁移至小室膜外表面的细胞数明显少于 Ad.NC 组（图7），提示下调 NRP1 表达可以显著抑制大鼠 VSMCs 的迁移。
图7
Transwell 检测下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 迁移的影响（20×10 倍）
*Ad.NC 组比较，
2.8 下调 NRP1 表达对其下游信号通路蛋白表达的影响
为了探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 中发挥生物学效应可能介导的下游信号通路，我们挑选了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 这 3 条 VSMCs 增殖迁移过程中的经典信号通路进行研究。采用 WB 检测 NRP1 下调后下游信号通路蛋白表达情况，结果显示 p-Akt 和 p-NF-κB 明显下降，而 t-Akt、t-NF-κB、t-ERK1/2 和 p-ERK1/2 无显著变化，说明抑制 NRP1 表达可以同时抑制其下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路激活，但对 MAPK/ERK 信号通路无明显影响。结果提示 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可通过介导下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路发挥作用（图8）。
图8
WB 检测下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 下游信号通路蛋白表达的影响
3 讨论
本研究发现，PDGF 可诱导大鼠 VSMCs 中 NRP1 表达上调，使用腺病毒 shRNA 靶向干扰 NRP1 在 VSMCs 中的表达，可显著抑制 PDGF 诱导的 VSMCs 增殖、迁移并促进细胞凋亡，表明 NRP1 对 VSMCs 的增殖与迁移具有重要的促进作用。同时，下调 NRP1 表达后，Akt 及 NF-κB 信号通路蛋白的磷酸化水平也明显降低，推测 NRP1 可通过介导下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路积极参与调控 VSMCs 的生物学功能。
中膜 VSMCs 的增殖和迁移是冠状动脉旁路移植术后静脉桥增殖重构进程中的关键环节[3-8]。静脉移植术后内皮细胞功能受损导致血小板和白细胞粘附聚集，大量促凝、促炎和生长因子释放，促使静脉中膜 VSMCs 由收缩型转换为合成型，大量增殖并向血管内膜迁移，同时分泌过量的细胞外基质，形成新生内膜，导致静脉桥管壁增厚发生再狭窄[3-8, 15-16]。在这一进程中，受损的内皮细胞、活化的 VSMCs 以及激活的血小板和巨噬细胞，均能分泌释放大量 PDGF[4, 17-18]。研究[12-14, 19-20]发现，PDGF 是一种强效的促有丝分裂因子，在 VSMCs 的表型转换及增殖、迁移过程中发挥了重要的促进作用。而通过抑制 PDGF 的表达或其受体的活化来阻断 PDGF 信号传导通路，可有效抑制 VSMCs 过度增殖和内向性迁移，从而减轻血管壁增殖性重构改变[21-24]。
NRP1 是一种多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可积极参与 PDGF 介导的信号转导，在 VSMCs 增殖、迁移和凋亡中发挥重要作用[12-14, 25-26]。本研究发现，NRP1 由 VSMCs 分泌产生，而 PDGF 可诱导其表达上调。Banerjee 等[26]在人体主动脉 VSMCs 中加入 PDGF（50 ng/mL），可刺激 NRP1 在基因和蛋白水平的表达分别增加 2.6 倍和 2.8 倍。研究发现[12-13]，NRP1 在 VSMCs 中可与 PDGF 受体 α（PDGFRα）共定位，而 PDGF-BB 通过与 PDGFRα–NRP1 复合物结合，在人体冠状动脉和大鼠主动脉 VSMCs 中发挥功能调节作用，而靶向抑制 NRP1 的表达，可干预 PDGF 诱导的 PDGFRα 磷酸化，从而抑制 VSMCs 迁移。因而，有人提出 NRP1 参与 VSMC 的生物学功能，可能主要是由于激活了 PDGF 的信号传导[12]。然而，Li 等[27]发现无论 PDGF-BB 刺激与否，过表达 MicroRNA-320 均会通过下调 NRP1 表达，抑制 VSMCs 的增殖与迁移。此外，作为 VEGF 的共受体，也有研究表明 NRP1 可在 VEGF 介导下促进 VSMCs 迁移[28-29]。本研究通过 shRNA 靶向抑制 NRP1 表达，不仅显著抑制了大鼠 VSMCs 的趋化迁移，同时也抑制了 VSMCs 增殖，并促进其凋亡。因而，我们推测 NRP1 表达上调可能会通过促进 VSMCs 的增殖和迁移，加速冠状动脉旁路移植术后静脉桥失效。
VSMCs 的增殖与迁移需要通过介导多种复杂的细胞传导通路完成。PI3K/Akt、MAPK/ERK 及 NF-κB 均是调控 VSMCs 生物学功能的经典信号通路，广泛参与了静脉桥增殖重构进程[30-34]。然而，这些通路在 NRP1 介导 VSMCs 增殖、迁移与凋亡的过程中究竟发挥怎样的作用，目前尚不明确。既往研究发现，不同的生长因子诱导下，NRP1 参与调控 VSMCs 功能所介导的信号通路也不尽相同[12, 27, 29]。Liu 等[29]发现，b-FGF 作为诱导剂刺激人 VSMCs 后，可激活 ERK1/2 及 NF-κB 信号途径，而对 Akt 的磷酸化却无影响；反之，特异性抑制 ERK1/2 和 NF-κB 信号通路，可明显下调 b-FGF 诱导的 VSMCs 中 NRP1 的表达，而 PI3K/Akt 的特异性抑制剂 wortmannin 对 NRP1 的表达并无影响。然而，Banerjee 等[28]的研究却发现 NRP1 有赖于 PI3K/Akt 途径参与 VEGF 诱导的人主动脉 VSMCs 迁移。而 Pellet-Many 等[12]发现，在 PDGF 诱导的人冠状动脉 VSMCs 中敲除 NRP1 基因，ERK1/2 和 Akt 的磷酸化水平没有降低，提示二者并不参与 NRP1 调控的 VSMCs 迁移。本研究中，靶向干扰 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表达后，可显著下调 Akt 和 NF-κB 磷酸化水平，而不抑制 ERK1/2 通路蛋白的激活。因此，我们推测 NRP1 可能通过其下游的 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路，参与大鼠 VSMCs 的增殖与迁移，而 MAPK/ERK 信号通路则不参与 NRP1 介导的该过程。
综上所述，本研究表明 NRP1 可能通过促进 VSMCs 的增殖与迁移，在静脉桥增殖重构进程中发挥潜在的促进作用，但尚需进一步的动物研究验证。除此之外，冠状动脉旁路移植术后静脉桥失效是一个极其复杂的过程，以 NRP1 为靶点的治疗策略是否有助于减少 NIH 形成，从而降低静脉桥失效发生率，需要进一步深入研究。
利益冲突：无。
作者贡献：刘宇负责实验设计与执行、撰写文章；张洪伟负责指导协助实验执行；杨鹏、黄尧负责资料收集与整理；卢晨负责图片编辑与排版；张煜负责统计分析；胡佳负责实验指导、论文审阅与修改。
由于人口老龄化及心血管病危险因素的日益流行，我国冠状动脉粥样硬化性心脏病的患病率及死亡率整体呈现逐年上升的趋势[1]。对于合并多支冠状动脉病变的患者，冠状动脉旁路移植术是其首选治疗方法[2]。但约有 30%～40% 的静脉桥会在术后 1 年内失效，高达 70% 的静脉桥在 10 年后将完全闭塞，严重影响患者的生活质量和远期生存[2]。
新生内膜增生（neointimal hyperplasia，NIH）及进行性粥样硬化是冠状动脉旁路移植术后静脉桥中远期失效的中心环节[3-8]。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和内向性迁移是 NIH 的关键因素[3-8]。因此，负向调控 VSMCs 的增殖迁移，可有效抑制 NIH 及静脉桥增殖性重构[8-10]。
血管损伤及血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等生长因子和细胞因子的刺激，可促使 VSMCs 发生表型转换及增殖迁移[3-4, 11-13]。研究[12-14]发现，神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1，NRP1）的表达上调与 PDGF 诱导的人和大鼠的 VSMCs 增殖迁移密切相关。但是，NRP1 在 VSMCs 生物学功能中的作用及相关调控机制尚未阐述清楚。本研究将通过 NRP1 基因干扰腺病毒靶向抑制 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表达，探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 增殖、凋亡和迁移中的功能作用以及其可能介导的相关下游信号传导通路，初步探讨 NRP1 在静脉桥增殖重构进程中的潜在作用。
1 材料与方法
1.1 细胞来源
本实验所用大鼠 VSMCs：型号 A7r5，购置于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（来源于美国 ATCC 公司，保持了原有细胞的基本生物学特性）。
1.2 主要实验试剂
主要实验试剂包括：NRP1 兔来源单克隆抗体（Abcam，英国）、胎牛血清（BioInd，以色列）、DMEM 培养基（Thermo Fisher，美国）、DMSO（Sigma，美国）、CCK-8 试剂盒（MCE，美国）、PBS（北京索莱宝）、PDGF-BB（Peprotech，#100-14B，美国）、蛋白上样指示剂（BIO-RAD，美国）、PVDF 膜（Millipore，美国）、RIPA 细胞/组织高效裂解液（北京索莱宝）及 Annexin V/PI 凋亡检测试剂盒（北京四正柏）。
1.3 主要实验器材
细胞培养箱（BINDER，美国）、脱色摇床（OHAUS，美国）、酶标仪（Bio TEX，美国）、电泳仪（BIO-RAD，美国）、化学成像系统（BIO-RAD，美国）、荧光定量 PCR 仪（BIO-RAD，美国）、流式分析仪（Beckman Coulter，Navios，美国）、倒置荧光显微镜（ZEISSm，OBSERVER D1，德国）、图像采集系统（ZEISS，AX10 cam HRC，德国）。
1.4 研究方法
1.4.1 NRP1 基因靶向干扰腺病毒的构建
委托上海吉凯基因化学技术有限公司完成。登录美国 Gene Bank 数据库（网址
1.4.2 大鼠 VSMCs 鉴定
采用 STR 多重荧光试剂盒对样品 DNA 进行扩增，然后使用 DNA 分析仪（Applied Biosystems）对 PCR 产物进行分析比对以排除大鼠 VSMCs 细胞被人源细胞交叉污染；通过对样品的 COX-1 基因进行扩增与电泳测试，获取基因条带，根据 COX-1 条带大小判断物种来源；制作大鼠 VSMCs 细胞爬片，通过免疫组化检测平滑肌细胞标志物 α-SMA 来确证该细胞系是否是平滑肌细胞。
1.4.3 检测大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达情况
1.4.3.1 实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）测定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达
细胞 RNA 采用 Magen 公司的 RaPure Total RNA Kit（单柱法）试剂盒进行提取。将提取到的总 RNA 逆转录合成 cDNA，逆转录体系中 RNA 的体积根据 RNA 浓度计算：需要的 RNA 质量/浓度，20 μL 逆转录体系中，SYBR Green qPCR 最多可使用 1 μg 总 RNA；在冰上配置去基因组 DNA 反应混合液；42 ℃ 反应 2 min，去除基因组 DNA；再在冰上配制逆转录反应混合液；瞬时离心，普通 PCR 仪进行逆转反应生成 cDNA（反应条件：37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s），所得 cDNA 于-20 ℃ 冰箱保存。使用 Primer Premier 6 软件设计 qPCR 引物序列，在 NCBI Primer-BLAST 中验证，使用 β-actin 作内参基因，配制 qPCR 反应混合物 10 μL，瞬时离心，荧光定量 PCR 仪上机检测，利用 Bio-Rad iQ 5 软件进行分析。确定 Ct 值，并计算 ΔCt 值（目标基因 Ct 值-内参 β-actin 的 Ct 值）。再计算 ΔΔCt（试验组 ΔCt-对照组 ΔCt），再以 2ΔΔCt 计算相对拷贝数。相同基因 ΔΔCt 越大，相对拷贝数就越低，基因表达量就越低。
1.4.3.2 WB 测定大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达
将培养瓶或 6 孔板放在冰块上，用预冷 PBS 洗涤细胞 2～3 次，吸干 PBS 后，再加入预冷的 RIPA，使用细胞刮将贴壁的细胞从培养瓶壁刮下，然后将悬液转移至新预冷 EP 管，冰上放置 30 min，每 10 min 振荡一次，4 ℃ 预冷离心机中 13 000 rpm 离心 15～20 min，取出 EP 管置于冰上，吸出上清到预冷的新管中，弃去沉淀。将提取到的细胞蛋白按照碧云天 BCA 试剂盒说明进行蛋白浓度的测定，经过 SDS-PAGE 电泳和转模后进行抗体结合和检测。
1.4.4 实验分组
（1）阴性对照腺病毒（Ad.NC）组 在含 10%FBS 的 DMEM 培养的大鼠 VSMCs 中，转染不含基因序列的阴性对照腺病毒。
（2）NRP1 干扰腺病毒（Ad.shNRP1）组 在含 10%FBS 的 DMEM 培养的大鼠 VSMCs 中，转染负载 NRP1-shRNA 的腺病毒。
将长势良好的 VSMCs 接种到培养皿中，待细胞融合达到 50% 时给予最佳稀释度的腺病毒进行转染。培养皿置于 37 ℃、5% CO2 的培养箱中孵育，病毒转染 48 h 后，细胞重新计数铺板，通过 qPCR 和 WB 检测 NRP1 表达情况，并分别进行细胞增殖活力、凋亡及迁移能力等检测。
1.4.5 CCK-8 检测细胞增殖活力
两组细胞的增殖活力采用 CCK-8（cell counting kit-8）试剂进行检测，其试剂中含有的 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐，能被线粒体中的酶还原为高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye），而黄色甲瓒产物的量与活细胞数量成正相关。
1.4.6 流式细胞术检测细胞凋亡情况
取病毒转染后 48 h 的 VSMCs，细胞重悬计数后接种于 6 孔板，培养 48 h 后将 VSMCs 制成细胞悬液，充分混匀后 2 000 rpm 离心 5 min，弃上清。加入 100 μL Binding Buffer 重悬细胞，然后加入 2 μL Annexic V-APC 混匀，再加入 1 μL PI，轻轻混匀后避光室温孵育 15 min，再补加 200 μL Binding Buffer，40 μm 滤网过滤后，进行流式检测。
1.4.7 Transwell 检测细胞迁移能力
取病毒转染 48 h 后的细胞重悬，每个 Transwell 小室加入 5×104个细胞。上室为无血清 DMEM 培养基 200 μL，下室加入含 10% FBS 的完全 DMEM 培养基 600 μL，注意小室底部不可有气泡。继续培养 48 h 后取出细胞，取出小室后首先需擦除里面的细胞及液体，然后在下室中加入甲醇 600 μL 固定 30 min，风干，再用结晶紫染色液 600 μL 染色 20 min 后用 PBS 洗涤后晾干。显微镜下计数 3 个不同视野中穿过膜的细胞数，并计算平均值，若细胞数较少时可全部计数。
为了探索 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可能通过哪些信号通路发挥作用，我们挑选了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 这三条 VSMCs 增殖迁移过程中的经典信号通路进行研究。靶向干扰大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达后，分别检测其下游 Akt、ERK1/2 及 NF-κB 通路蛋白磷酸化和总表达水平的变化，推测 NRP1 在大鼠 VSMCs 中发挥作用可能介导的信号通路。
1.5 统计学分析
应用 SPSS 19.0 统计软件（SPSS Inc，Chicago，IL，美国）进行数据统计分析，GraphPad Prism 6 软件（GraphPad Inc，La Jolla，CA，美国）作图。数据以均数±标准差（±s）表示，两组之间比较使用独立样本 t 检验，而多组之间比较则采用单因素方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠 VSMCs 鉴定结果
本研究中所使用的细胞在 STR 图谱中未检测到扩增峰，表明未受到人源细胞污染（图1a）。
图1
大鼠血管平滑肌细胞鉴定结果
a：STR 基因分型图谱；b：COX-1 基因电泳图谱（条带位于 196bp 处，常见物种 COX-1 基因大小：人类 391bp；恒河猴 287bp；长尾猴 222bp；牛 102bp；犬 172bp；大鼠 196bp；小鼠 150bp；仓鼠 315bp；昆虫 70bp）；c：免疫组化结果，红色为 α-SMA 蛋白，绿色为 DAPI 染色的细胞核（20×10 倍）
在 COX-1 基因电泳中，将仅有的位于 196bp 的条带与常见物种 COX-1 基因大小进行对比，提示本研究所使用的的细胞来源于大鼠并且不存在物种污染（图1b）。
细胞免疫组化结果显示 VSMCs 标志物 α-SMA 阳性表达，进一步证实本研究所使用的细胞为未受污染的大鼠 VSMCs（图1c）。
2.2 PDGF 及腺病毒的浓度选择
分别使用 0 ng/mL，15 ng/mL 和 30 ng/mL 的 PDGF-BB 诱导大鼠 VSMCs，通过 qPCR 和 WB 检测发现，在基因转录和翻译两种水平，NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表达均随着 PDGF 的诱导剂量逐渐增高，提示 PDGF 能够促进 NRP1 的表达（图2a）。因此，我们采用 30 ng/mL 的 PDGF-BB 进行后续研究。
图2
PDGF 及腺病毒的浓度选择
a：大鼠 VSMCs 中 NRP1 在不同浓度 PDGF 诱导下的表达情况（*：与 0 ng/mL 组比较，
使用构建的腺病毒感染大鼠 VSMCs，病毒转染后 48 h，采用流式细胞术检测 VSMCs 的存活率及荧光表达率。研究发现（图2b），在腺病毒 10–3稀释度下，VSMCs 的存活率为 85.4%，标记腺病毒的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表达率为 93.4%；而在病毒 10-4稀释度下，VSMCs 存活率为 92.1%，GFP 表达率为 91.7%。综合评估得出腺病毒在 10-3稀释度下，对 VSMCs 可达到最佳的转染效果，遂以此稀释度下的病毒浓度进行后续实验。
2.3 腺病毒成功转染大鼠 VSMCs
荧光显微镜下可以看到 NRP1-shRNA 腺病毒和阴性对照腺病毒均成功转染 VSMCs（图3a）。通过流式细胞术检测观察到两组 GFP 表达率均达到 80%，病毒转染效率未见明显差别，满足细胞功能及机制研究的要求（图3b）。
图3
腺病毒成功转染大鼠血管平滑肌细胞
a：荧光显微镜下观察腺病毒在大鼠 VSMCs 中转染效率（20×10 倍）；b：流式细胞术检测腺病毒在大鼠 VSMCs 中转染效率
2.4 NRP1 基因靶向干扰腺病毒抑制大鼠 VSMCs 中 NRP1 的表达
通过 qPCR 及 WB 检测，NRP1 基因靶向干扰腺病毒转染大鼠 VSMCs 后，在基因及蛋白水平，NRP1 的表达均被显著抑制（图4）。
图4
靶向干扰腺病毒抑制 NRP1 在 VSMCs 中的表达
*：与 Ad.NC 组比较，
2.5 下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 增殖活力的影响
在探究 NRP1 对大鼠 VSMCs 具体生物学功能的影响时，首先采用 CCK-8 实验检测增殖活力的变化，结果显示在 24 h、48 h 和 72 h 时，Ad.NRP1 组细胞的增殖活力较 Ad.NC 组均有明显降低（图5），提示 NRP1 表达下调可以抑制大鼠 VSMCs 的增殖活力。
图5
CCK-8 检测 NRP1 表达下调对大鼠 VSMCs 增殖的影响
*：与 Ad.shNRP1 组比较，
2.6 下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 凋亡的影响
为了研究下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 凋亡的影响，我们采用了 Annexin V-APC/PI 双染法流式细胞术检测凋亡百分比，结果显示 Ad.NRP1 组细胞凋亡百分比显著高于 Ad.NC 组（图6），表明下调 NRP1 表达促进了大鼠 VSMCs 的凋亡。
图6
流式细胞术检测下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 凋亡的影响
*：与 Ad.NC 组比较，
2.7 下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 迁移能力的影响
在检测了抑制 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 增殖和凋亡的影响之后，进一步采用 Transwell 实验检测迁移能力的变化，结果显示 Ad.NRP1 组迁移至小室膜外表面的细胞数明显少于 Ad.NC 组（图7），提示下调 NRP1 表达可以显著抑制大鼠 VSMCs 的迁移。
图7
Transwell 检测下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 迁移的影响（20×10 倍）
*Ad.NC 组比较，
2.8 下调 NRP1 表达对其下游信号通路蛋白表达的影响
为了探究 NRP1 在大鼠 VSMCs 中发挥生物学效应可能介导的下游信号通路，我们挑选了 PI3K/Akt、MAPK/ERK 和 NF-κB 这 3 条 VSMCs 增殖迁移过程中的经典信号通路进行研究。采用 WB 检测 NRP1 下调后下游信号通路蛋白表达情况，结果显示 p-Akt 和 p-NF-κB 明显下降，而 t-Akt、t-NF-κB、t-ERK1/2 和 p-ERK1/2 无显著变化，说明抑制 NRP1 表达可以同时抑制其下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路激活，但对 MAPK/ERK 信号通路无明显影响。结果提示 NRP1 在大鼠 VSMCs 中可通过介导下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路发挥作用（图8）。
图8
WB 检测下调 NRP1 表达对大鼠 VSMCs 下游信号通路蛋白表达的影响
3 讨论
本研究发现，PDGF 可诱导大鼠 VSMCs 中 NRP1 表达上调，使用腺病毒 shRNA 靶向干扰 NRP1 在 VSMCs 中的表达，可显著抑制 PDGF 诱导的 VSMCs 增殖、迁移并促进细胞凋亡，表明 NRP1 对 VSMCs 的增殖与迁移具有重要的促进作用。同时，下调 NRP1 表达后，Akt 及 NF-κB 信号通路蛋白的磷酸化水平也明显降低，推测 NRP1 可通过介导下游 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路积极参与调控 VSMCs 的生物学功能。
中膜 VSMCs 的增殖和迁移是冠状动脉旁路移植术后静脉桥增殖重构进程中的关键环节[3-8]。静脉移植术后内皮细胞功能受损导致血小板和白细胞粘附聚集，大量促凝、促炎和生长因子释放，促使静脉中膜 VSMCs 由收缩型转换为合成型，大量增殖并向血管内膜迁移，同时分泌过量的细胞外基质，形成新生内膜，导致静脉桥管壁增厚发生再狭窄[3-8, 15-16]。在这一进程中，受损的内皮细胞、活化的 VSMCs 以及激活的血小板和巨噬细胞，均能分泌释放大量 PDGF[4, 17-18]。研究[12-14, 19-20]发现，PDGF 是一种强效的促有丝分裂因子，在 VSMCs 的表型转换及增殖、迁移过程中发挥了重要的促进作用。而通过抑制 PDGF 的表达或其受体的活化来阻断 PDGF 信号传导通路，可有效抑制 VSMCs 过度增殖和内向性迁移，从而减轻血管壁增殖性重构改变[21-24]。
NRP1 是一种多功能的非酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，可积极参与 PDGF 介导的信号转导，在 VSMCs 增殖、迁移和凋亡中发挥重要作用[12-14, 25-26]。本研究发现，NRP1 由 VSMCs 分泌产生，而 PDGF 可诱导其表达上调。Banerjee 等[26]在人体主动脉 VSMCs 中加入 PDGF（50 ng/mL），可刺激 NRP1 在基因和蛋白水平的表达分别增加 2.6 倍和 2.8 倍。研究发现[12-13]，NRP1 在 VSMCs 中可与 PDGF 受体 α（PDGFRα）共定位，而 PDGF-BB 通过与 PDGFRα–NRP1 复合物结合，在人体冠状动脉和大鼠主动脉 VSMCs 中发挥功能调节作用，而靶向抑制 NRP1 的表达，可干预 PDGF 诱导的 PDGFRα 磷酸化，从而抑制 VSMCs 迁移。因而，有人提出 NRP1 参与 VSMC 的生物学功能，可能主要是由于激活了 PDGF 的信号传导[12]。然而，Li 等[27]发现无论 PDGF-BB 刺激与否，过表达 MicroRNA-320 均会通过下调 NRP1 表达，抑制 VSMCs 的增殖与迁移。此外，作为 VEGF 的共受体，也有研究表明 NRP1 可在 VEGF 介导下促进 VSMCs 迁移[28-29]。本研究通过 shRNA 靶向抑制 NRP1 表达，不仅显著抑制了大鼠 VSMCs 的趋化迁移，同时也抑制了 VSMCs 增殖，并促进其凋亡。因而，我们推测 NRP1 表达上调可能会通过促进 VSMCs 的增殖和迁移，加速冠状动脉旁路移植术后静脉桥失效。
VSMCs 的增殖与迁移需要通过介导多种复杂的细胞传导通路完成。PI3K/Akt、MAPK/ERK 及 NF-κB 均是调控 VSMCs 生物学功能的经典信号通路，广泛参与了静脉桥增殖重构进程[30-34]。然而，这些通路在 NRP1 介导 VSMCs 增殖、迁移与凋亡的过程中究竟发挥怎样的作用，目前尚不明确。既往研究发现，不同的生长因子诱导下，NRP1 参与调控 VSMCs 功能所介导的信号通路也不尽相同[12, 27, 29]。Liu 等[29]发现，b-FGF 作为诱导剂刺激人 VSMCs 后，可激活 ERK1/2 及 NF-κB 信号途径，而对 Akt 的磷酸化却无影响；反之，特异性抑制 ERK1/2 和 NF-κB 信号通路，可明显下调 b-FGF 诱导的 VSMCs 中 NRP1 的表达，而 PI3K/Akt 的特异性抑制剂 wortmannin 对 NRP1 的表达并无影响。然而，Banerjee 等[28]的研究却发现 NRP1 有赖于 PI3K/Akt 途径参与 VEGF 诱导的人主动脉 VSMCs 迁移。而 Pellet-Many 等[12]发现，在 PDGF 诱导的人冠状动脉 VSMCs 中敲除 NRP1 基因，ERK1/2 和 Akt 的磷酸化水平没有降低，提示二者并不参与 NRP1 调控的 VSMCs 迁移。本研究中，靶向干扰 NRP1 在大鼠 VSMCs 中的表达后，可显著下调 Akt 和 NF-κB 磷酸化水平，而不抑制 ERK1/2 通路蛋白的激活。因此，我们推测 NRP1 可能通过其下游的 PI3K/Akt 及 NF-κB 信号通路，参与大鼠 VSMCs 的增殖与迁移，而 MAPK/ERK 信号通路则不参与 NRP1 介导的该过程。
综上所述，本研究表明 NRP1 可能通过促进 VSMCs 的增殖与迁移，在静脉桥增殖重构进程中发挥潜在的促进作用，但尚需进一步的动物研究验证。除此之外，冠状动脉旁路移植术后静脉桥失效是一个极其复杂的过程，以 NRP1 为靶点的治疗策略是否有助于减少 NIH 形成，从而降低静脉桥失效发生率，需要进一步深入研究。
利益冲突：无。
作者贡献：刘宇负责实验设计与执行、撰写文章；张洪伟负责指导协助实验执行；杨鹏、黄尧负责资料收集与整理；卢晨负责图片编辑与排版；张煜负责统计分析；胡佳负责实验指导、论文审阅与修改。
